1Visualizar la interacción primaria: la lógica del marcado
La interacción primaria antígeno-anticuerpo no es visible por sí misma. La estrategia general de este grupo de técnicas consiste en "marcar" al antígeno o al anticuerpo mediante la unión covalente (conjugación) de una molécula detectable —fluorocromo, isótopo radioactivo o enzima—. Según el marcador utilizado, la técnica recibe un nombre distinto y utiliza un sistema de detección diferente. Estas técnicas son más laboriosas y costosas que las de interacción secundaria (capítulo II.3), pero considerablemente más sensibles, capaces de detectar concentraciones mucho menores de antígeno o anticuerpo.
2Inmunomarcación directa e indirecta
Las técnicas de inmunomarcación con anticuerpos conjugados permiten detectar antígenos en tejidos (inmunohistoquímica) o células (inmunocitoquímica), sean de membrana, citoplasmáticos, nucleares o de matriz extracelular.
| Modalidad | Fundamento |
|---|---|
| Inmunomarcación directa | Se incuba la muestra con un anticuerpo primario ya marcado, específico para el antígeno de interés; se lava el exceso y se detecta la marca |
| Inmunomarcación indirecta | Se incuba primero con un anticuerpo primario sin marcar; luego, un anticuerpo secundario marcado (dirigido contra el anticuerpo primario, por ejemplo anti-IgG de ratón hecho en conejo) permite evidenciar la unión — amplifica la señal respecto de la técnica directa |
El marcador conjugado puede ser una enzima (habitualmente peroxidasa; el sustrato incoloro agregado —"cromógeno"— vira a un producto coloreado visible al microscopio óptico) o un fluorocromo (emite luz de una longitud de onda específica al ser excitado; técnica conocida como inmunofluorescencia). Distintos cromógenos o fluorocromos permiten detectar simultáneamente varios antígenos diferentes en el mismo corte de tejido o célula.
3Citometría de flujo
La citometría de flujo (CMF) es un procedimiento altamente eficiente para caracterizar cuali- y cuantitativamente poblaciones celulares en suspensión. Originalmente se usaba para identificar el fenotipo celular (expresión diferencial de antígenos de membrana), pero actualmente mide numerosos parámetros estructurales y funcionales adicionales.
Las células en suspensión son forzadas a pasar de a una a través de un filamento delgado; un haz de láser incide sobre cada célula, dispersando la luz en distintas direcciones. Tubos fotomultiplicadores detectan esa luz dispersada, brindando información sobre tamaño, granularidad/complejidad celular, y —si la célula unió un anticuerpo marcado con fluorocromo— la intensidad de fluorescencia. Sus principales ventajas frente a la microscopía de fluorescencia son la capacidad de analizar un número muy elevado de células en segundos, y de cuantificar objetivamente la intensidad de fluorescencia; su principal desventaja es el alto costo del equipo.
| Tipo de gráfico | Qué muestra |
|---|---|
| Dot plot tamaño vs. granularidad | Sin marcado con anticuerpos, ya distingue poblaciones leucocitarias por su morfología: neutrófilos (alta granularidad, por sus lisosomas), monocitos (tamaño mayor, granularidad intermedia) y linfocitos (pequeños, sin gránulos) |
| Histograma de fluorescencia | Distribución de la intensidad de fluorescencia de una población marcada con un único anticuerpo (por ejemplo, anti-CD18-FITC) |
| Dot plot de dos fluorescencias (FL1 vs. FL2) | Permite distinguir subpoblaciones marcadas simultáneamente con dos anticuerpos distintos — por ejemplo, anti-CD4-FITC (verde) y anti-CD8-PE (rojo), diferenciando linfocitos T CD4+, T CD8+ y células doble negativas (B, NK) en un mismo análisis |
4Radioinmunoanálisis y técnicas radioinmunométricas
El RIA (radioinmunoanálisis) cuantifica pequeñas cantidades de antígeno o anticuerpo mediante inhibición competitiva: se enfrenta una mezcla de antígeno marcado radioactivamente ("caliente") unido a su anticuerpo específico, con la muestra que contiene el mismo antígeno sin marcar ("frío"). Cuanto mayor la concentración de antígeno frío en la muestra, mayor el desplazamiento del antígeno caliente de los complejos —permitiendo calcular la concentración de antígeno en la muestra mediante una curva patrón—. Hoy en día ha sido en gran parte reemplazado por técnicas que no requieren radioisótopos.
Las técnicas radioinmunométricas (no deben confundirse con el RIA, ya que no se basan en desplazamiento competitivo) incluyen el PRIST (mide IgE total en suero, elevada característicamente en pacientes alérgicos) y el RAST (mide IgE específica contra un alérgeno particular) — ambas útiles en el diagnóstico de hipersensibilidad tipo I (capítulo VII.1).
5ELISA
El ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) utiliza anticuerpos marcados con una enzima (habitualmente peroxidasa) para visualizar la reacción antígeno-anticuerpo. Se usa tanto para determinar antígenos como anticuerpos, según dos modalidades distintas:
| Modalidad | Fundamento |
|---|---|
| ELISA sandwich (para determinar antígeno) | Un anticuerpo específico está adsorbido al soporte sólido; si el antígeno está presente en la muestra, queda capturado, y se revela con un segundo anticuerpo específico conjugado a la enzima; el sustrato genera un producto coloreado cuantificable por espectrofotometría |
| ELISA indirecto (para determinar anticuerpos) | El antígeno de interés está adsorbido a la placa; el suero del paciente se incuba sobre él, y si contiene anticuerpos específicos quedan capturados, revelados por un anticuerpo secundario anti-inmunoglobulina humana conjugado a la enzima |
El ELISA indirecto es la técnica de elección para el rastreo (screening) inicial de anticuerpos contra proteínas del VIH en sueros de pacientes.
6Otras técnicas de laboratorio
| Técnica | Fundamento | Aplicación |
|---|---|---|
| Proteinograma electroforético | Separa las proteínas del suero (u otro fluido) en 5 fracciones —albúmina, α1, α2, β y γ globulinas— mediante electroforesis en agarosa o acetato de celulosa | Detección de patrones proteicos alterados; el pico monoclonal en la fracción γ es característico del mieloma múltiple |
| Nefelometría | Método óptico que cuantifica la luz dispersada por complejos inmunes formados al incubar el suero con exceso de anticuerpo específico, proporcional a la concentración del antígeno | Cuantificación de IgM, IgG e IgA séricas |
| Western blot | Separación electroforética de proteínas en geles de poliacrilamida (con SDS, para que la migración dependa del peso molecular), transferencia a una membrana sólida, y detección de bandas específicas con anticuerpos | Prueba confirmatoria de elección tras un ELISA indeterminado o reactivo para VIH — permite ver qué proteínas virales específicas reconoce el suero del paciente |
¿Por qué el diagnóstico de VIH combina ELISA y Western blot en vez de usar solo uno? El ELISA indirecto es muy sensible (detecta casi todos los verdaderos positivos) pero menos específico, por lo que puede dar resultados falsamente reactivos. El Western blot, en cambio, es mucho más específico porque muestra exactamente contra qué proteínas virales individuales reacciona el suero del paciente (separadas por peso molecular), permitiendo distinguir una reactividad verdadera de una reacción cruzada inespecífica. La estrategia de dos pasos —ELISA como tamizaje sensible, Western blot como confirmación específica— minimiza tanto los falsos negativos como los falsos positivos, un principio general de diagnóstico serológico que reaparece en el capítulo VIII.2.
7Trampas de examen
| Trampa | Por qué confunde | Aclaración |
|---|---|---|
| Confundir ELISA sandwich con ELISA indirecto | Ambos usan un anticuerpo adsorbido a la placa | El sandwich detecta antígeno (el anticuerpo de captura y el de revelado son distintos anticuerpos contra el mismo antígeno); el indirecto detecta anticuerpo del paciente (el antígeno está fijo en la placa, y se revela con un anti-inmunoglobulina humana) |
| Pensar que RIA y las técnicas radioinmunométricas (PRIST, RAST) son sinónimos | Ambas usan isótopos radioactivos | El RIA se basa en inhibición competitiva por desplazamiento de antígeno marcado; PRIST y RAST no compiten por desplazamiento, sino que detectan directamente la unión del anticuerpo marcado |
| Creer que la citometría de flujo requiere siempre anticuerpos marcados | Se la asocia siempre con inmunofenotipo | Un dot plot de tamaño vs. granularidad ya distingue poblaciones leucocitarias por su morfología física, sin necesidad de ningún anticuerpo — el uso de anticuerpos marcados agrega información adicional (fenotipo), pero no es indispensable para todo análisis por CMF |
8Puntos clave
- Las técnicas de interacción primaria (inmunomarcación, ELISA, RIA, citometría) son más sensibles que las de interacción secundaria, al detectar directamente la unión Ag-Ac mediante un marcador conjugado.
- ELISA sandwich detecta antígeno; ELISA indirecto detecta anticuerpo del paciente.
- Western blot separa proteínas por peso molecular y es la prueba confirmatoria de elección tras un ELISA reactivo/indeterminado para VIH.
- La citometría de flujo mide tamaño, granularidad y fluorescencia de células individuales en suspensión, permitiendo caracterizar subpoblaciones leucocitarias con gran velocidad.